Sem. 8 GEN: Técnicas II

Programa

SG8: CROMOSOMOPATÍAS I TECNICAS DE CITOGENETICA CLASICA Y MOLECULAR El cariotipo
humano. Nomenclatura. Revisión del concepto de cromosoma. Cromosomas, estados de la
cromatina y ciclo celular. Tipos de cromosomas: metacéntricos; submetacéntricos y
acrocéntricos. Estudios del material cromosómico: utilidad y fundamentos de las técnicas de
citogenética clásica y molecular: Cariotipo con bandeo G; Cariotipo de alta resolución; FISH
(Hibridación in situ y fluorescencia); Micromatrices de ADN (CGH‐arrays); MLPA (multiplex
ligation-dependent probe amplification). Clasificación de las anomalías cromosómicas:
numéricas y estructurales.

Técnicas 2

• Permiten el estudio y función de los cromosomas
• Número y estructura de los cromosomas

 

Se tratará el cómo funciona cada técnica y bajo qué condiciones se ocupa la misma

Cariotipo: principal técnica de estudio en citogenética

• Fundamental: gracias a esta técnica, se funda el campo de la citogenética
• Antes de 1956 no sabía el número de cromosomas en humanos
• 1959 : en tres cortos años, ya se identifica el síndrome de Down como una cromosopatia
• Se logran ver cromosomas en estado condensado

Pasos:

1.-Muestra de sangre

2.-Se centrifuga, se separan eritrocitos-glóbulos blancos-etc

3.-Se toman leucocitos en G0

4.-Se incuban para que entren en mitosis, donde se condensa el material genético

5.-Solo algunos tienen su ADN condensado ¿cómo hacer para sincronizarlos? Se utiliza colchicina, que impide la formación de microtubulos, por ende, los cromosomas no podrán segregarse

6.-La anafase no puede ocurrir gracias a la colchicina, sincronizándose los cromosomas en metafase

7.-Se explotan las células, y se cuenta el número de cromosomas

8.-Para poder realizar la visualización se utilizan colorante de Hensen, que tiñe cada cromosoma en diferentes colores

9.-Se obtiene el cariograma

 

• Gracias a esta técnica se pueden observar cromosopatías en desarrollos embrionarios, sin afectar al embrión.
• La técnica, no es rápida. Requiere de alrededor de diez para que se cultiven las células

¿Qué anomalías se logran ver con esta técnica?

• Numéricas: síndrome de Down, Turner, Patau, Edwards
• Estructurales: tienen que superar las 5 millones de bases para poder visualizarse
• Inversiones cromosómicas
• Translocaciones: intercambio de ADN entre cromosomas no homólogos

¿Se devela todo entonces?

• Existe un número mínimo de alteraciones de pb (5MB) para que se puedan visualizar
• Hay variaciones de mayor resolución -> Cariotipo de alta resolución
• El cariotipo de alta resolución -> se detectan anomalías desde los 2MB
• En conclusión, las alteración que se pueden dilucidar gracias al cariotipo tienen que ser enormes

¿Cómo resolver este dilema? -> Técnica de FISH

• Aumenta el grado de observación
• Límite: 100.000 pb -> claramente menor a las técnicas de cariotipo

¿Cómo funciona?

• Fragmentos de ADN complementario a aquella región que quiero identificar
• Se marcan con fluróforos, hibridándose a nuestra muestra biológica

Pasos:

1.-Se detecta secuencia de ADN a estudiar

2.-Se crea sonda de ADN complementario

3.-Se marca sonda con fluróforo

4.-Se hibrida ADN a sonda marcada

5.-Se observa fluorescencia

Sólo se ve, en consecuencia, la fluorescencia emitida por la sonda, es una técnica sesgada. Usándose bajo cierta sospecha del clínico de poseer cierta anomalía

Ambas, cariotipo y FISH, se suelen solicitar en conjunto, siendo FISH mucho más rápida

 

Técnica de CGH-Array/CGH-Comparativo

• Permite ver desbalances muy pequeños, de hasta 1.000 pares de bases
• Se fundamenta en comparar un ADN control con el de un paciente

1.-Extraemos ambos ADN

2.-Se fragmenta el ADN mecánicamente

3.-Al control se le agrega un fluoróforo distinto al del paciente

4.-Se intentan complementar ambas porciones del ADN, donde todas las posiciones del ADN están representadas

5.-Se expresa ADN dando un color que proviene de la combinación de ambos fluróforo:

• Donde hay predominancia del color control: deleción
• Donde hay predominancia del color paciente: duplicación
• Donde no predomina ninguno de los dos colores: igual carga genética control/paciente

Polimorfismos: los individuos varían entre sí en si ADN, pero es totalmente normal, no patológico. CGH-comparativo puede ayudar a evidenciar estos polimorfismos. Se deberá observar si tal variante es patológica: existen alrededor de 24.000 variantes de alrededor de 1.000 pb que no representan ninguna patología

 

Variante de CGH-comparativos -> MLPA

• Menos potente que el CGH
• Sigue comparando dos ADN
• Mucho más barata -> llevándose su uso al aspecto clínico
• 50 a 60 porciones del genoma -> se generan sondas, claramente de diferente tamaño

Pasos:

1.-Se desnaturaliza el ADN por calor

2.-Se une sonda por complementariedad de bases

3.-Se purifica preparado, quitando sondas que no se hayan unido

4.-Para detectar sondas unidas se aplica una PCR, aumentando de manera exponencial el material genético que se podrá visualizar a medida que ocurre cada ciclo

5.-Mediante un análisis de fragmentos y aprovechando la diferencia de tamaños (electroforesis) de cada una de las sondas, se podrán detectar alteraciones

6.-Se compara con individuos controles (puede ser 1)

Esta técnica, es muy precisa. No se compara absolutamente todo el ADN, sino regiones bastante específicas del mismo. Requiere de una sospecha clínica previa

Multimedia: TP 8 Histología

Tubo digestivo y glándulas salivales

TP 8 Histo: Tubo digestivo y Glándulas salivales

Parte I

Generalidades del tubo digestivo

El aparato digestivo es un tubo que se extiende desde la boca hasta el ano. El tubo está formado por cuatro órganos mayores, que son: esófago, estómago, intestino delgado e intestino grueso. En varios sitios a lo largo del tubo hay esfínteres que controlan el paso del contenido de un órgano al siguiente

En general, la pared del tubo del adulto está constituida por cuatro capas concéntricas, que tienden a ser constantes. A partir de la luz del tubo, éstas se denominan capa mucosa, capa submucosa, capa muscular y capa adventicia o serosa

1. A) La capa mucosa a su vez está integrada por tres capas que son epitelio, lámina propia de tejido conectivo colágeno laxo y capa muscular de la mucosa.
2. B) La submucosa es también tejido conectivo colágeno laxo y presenta el plexo nervioso de Meissner que se puede apreciar de mejor manera en yeyuno-íleon
3. C) La muscular externa son dos capas de músculo liso (excepto en el tercio superior de esófago, que es de músculo estriado esquelético), una capa interna dispuesta de forma circular y una capa externa dispuesta de forma longitudinal, además presenta el plexo mientérico de Auerbach entre sus hojas
4. D) La adventicia está formada por tejido conectivo con abundantes vasos y nervios que llegan al órgano, si la estructura está cubierta por peritoneo (epitelio plano simple/mesotelio) se le denomina serosa

 

Esófago

*Se puede observar mucosa y submucosa. Se intenta marcar acinos mucosos en la submucosa

Como todo órgano hueco, se describe desde la luz central hacia fuera, describiendo cada una de las capas y sus características

1.-Mucosa:

-Epitelio: plano estratificado, no queratinizado. Muchas veces, solamente con ver este epitelio podemos dar diagnóstico diferencial

-Lámina propia (tejido conectivo subyacente): colágeno denso

-Muscular interna: parches discontinuos de músculo liso, el cual se puede ver en cortes transversales

2.-Submucosa: encontramos acinos mucosos (nucleo basal) inmersos en TCCD.

3.-Muscular externa: tiene tres porciones

-tercio superior: músculo estriado esquelético

-tercio medio: músculo estriado esquelético con liso

-tercio inferior: músculo liso

Esto principalmente ocurre para que podamos decidir cuándo tragar y poder así controlar el flujo del bolo alimenticio más proximalmente

4.-Adventicia: TCCL con vasos y nervios

 

Estomago

*Se marca mucosa del estómago

1.-Mucosa:

-Epitelio: cilíndrico simple de tinción palida por glucoproteínas (no son células caliciformes). Este epitelio se va a ir invaginando para generar fositas/criptas que luego se continuarán como glándulas propiamente dichas

-Lámina propia: sobre la lámina propia se van a apoyar las glándulas propiamente dichas con sus cuatro porciones:

a.Itsmo

b.Cuello: acidófilo por mitocondrias

c.Cuerpo: acidófilo por mitocondrias y células parietales

d.Fondo: basófilo por células principales

Células parietales: encargadas de producir el ácido clorhídrico, aumentar el PH y desnaturalizar proteínas para ser hidrolizadas y generar así el inicio la digestión del bolo alimentario. Son muy acidófilas

*Se marca una célula parietal

Células principales: sintetizan pepsinógeno el cual al liberarse y contactar con un ambiente ácido en el estómago, pasa a su forma activa (pepsina) para colaborar con la hidrolisis de proteínas. Son células basófilas por su alto desarrollo de REG y aparto de Golgi

-Muscular interna: una capa circular interna y otra longitudinal externa

2.-Submucosa: TCCD, no modelado, de acidofilia pálida

3.-Muscular externa: consta de tres capas:

a.Interna: oblicua

b.Media: circular

c.Externa: longitudinal

4.-Serosa: TCCL con mesotelio

 

Duodeno

*Se aprecia campo de duodeno

1.-Mucosa: vellosidades muy poco desarrolladas y en poca cantidad

-Epitelio: cilíndrico simple con células caliciforme y glándulas de Lieberkuhn

-Lámina propia: TCCL

-Muscular propia

2.-Submucosa: se caracteriza por la presencia de glándulas de Brunner, presentes en la submucosa que pueden ser tan abundantes que atraviesen la muscular de la mucosa hacia el corion. Son glándulas tubuloalveolares secretoras de mucus que vacían su secreción en las criptas intestinales. Su alcalinidad permite neutralizar el quimo ácido proveniente del estomago

*Se marcan glándulas de Brunner

3.-Muscular: circular interna y longitudinal externa

4.-Serosa: TCCL con mesotelio

 

Yeyuno-Íleon

*Campo de yeyuno-íleon

1.-Mucosa: están particularmente desarrolladas las vellosidades, que alcanzan 1 mm de longitud, mientras que las glándulas de Lieberkühn son muy profundas y contactan con la muscular de la mucosa. En los cortes histológicos se observan múltiples cortes transversales de vellosidades y de glándulas tanto en la luz como en la mucosa. Para su diagnóstico diferencial es preciso tener en cuenta que las vellosidades poseen corion en el centro y son rodeadas por la luz, mientras que en las glándulas la luz es interna y el corion externo

Hay mayor proporción de células caliciformes que en el duodeno. El número aumenta hacia el íleon-así como el número de nódulos linfáticos-, donde pueden encontrarse placas de Peyer, cúmulos de tejido linfático que protruyen hacia la luz haciendo desaparecer las vellosidades y las glándulas de la mucosa.

Las criptas de Lieberkühn se alojan en la lámina propia, apoyadas sobre la capa muscular interna, donde se pueden apreciar las células de Paneth, que juegan un papel importante en la generación de respuestas inmunes contra las bacterias que se introducen a través de la vía oral

*Se aprecian vellosidades (mucosa)

Existen 5 tipos de células en estas vellosidades:

1.-Célula cilíndrica indiferenciada. La célula posee citoplasma basófilo y puede encontrarse en distintos estados de división. Están en la base de las glándulas

2.-Células absortivas <<enterocitos>>. Poseen citoplasma levemente acidófilo con abundantes microvellosidades en su cara apical, lo cual aumenta unas 20 veces la superficie de absorción. Estas células son las más abundantes en la vellosidad intestinal

Los pliegues de Kerckring, las vellosidades y las microvellosidades aumentan tanto la superficie de absorción, que, desplegada cubriría una superficie de 200 metros cuadrados, pues se necesita una gran superficie para la absorción de de alimentos

3.-Células caliciformes. Están entremezcladas con los otros tipos celulares, producen secreción mucosa en forma discontinua, y se cargan de mucus para excretarlo es su totalidad una vez la célula está llena, para luego empezar con otro ciclo. Su forma es globulosa y protruyen entre los enterocitos. Son fácilmente distinguibles con H&E, ya que  su tinción es negativa. Se las puede identificar de forma específica con PAS

4.-Células argentafines. Son menos abundantes y están presentes en el fondo de las criptas. Pertenecen al sistema neuroendocrino difuso (SNED) al igual que las descritas en el estómago

5.-Células de Paneth. Están presentes en el fondo de las criptas, poseen forma piramidal y son productoras de enzimas antibacterianas, entre ellas la lisozima y la a-defensina, que le dan una intensa acidofilia a la superficie apical. Se las puede encontrar en el humano, los simios y la rata. Se supone que estas células participan en la regulación de la flora bacteriana

En el epitelio es posible encontrar linfocitos con relativa frecuencia.

El epitelio descansa sobre una membrana basal delgada; el tejido conectivo que forma el centro de la vellosidad intestinal es de tipo conectivo reticular laxo, muy celular y sumamente vascularizado, con capilares que reciben el material absorbido. Una característica importante en la mucosa de la vellosidad es la presencia de un capilar linfático (vaso quilífero) en el eje de ésta, que asimismo es acompañado por un eje de músculo liso proveniente de la muscular de la mucosa: el músculo de Brücke, cuya contracción favorece la absorción

*Se aprecian glándulas de Lieberkühn, se marca submucosa

2.-Submucosa: no hay glándulas, veo vasos y plexo de Meissner/submucoso para el peristaltismo del tubo

3.-Muscular externa: circular interna y longitudinal externa. Entre estas dos capas de músculo liso se puede apreciar el plexo de Auerbach/mientérico

*Se marca plexo de Auerbach, entre las dos capas de músculo liso

4.-Serosa: TCCL con mesotelio

 

Intestino Grueso

*Campo de intestino grueso

1.-Mucosa: No posee pliegues de Kerckring ni vellosidades, pero sí glándulas de Lieberkühn, conocidas en este caso como criptas colónicas

*Epitelio del intestino grueso, en contacto con la luz

-Epitelio: cilíndrico simple, sin vellosidades y con muchas células caliciformes.

-Lámina propia: gran cantidad de folículos linfáticos aislados, que por el tamaño protruyen

-Muscular interna

2.-Submucosa: gran cantidad de células adiposas

3.-Muscular externa: músculo liso, capa circular interna y longitudinal externa, formando las tenias

*Se observa músculo liso, formando las tenias del colon

4.-Serosa: TCCL con mesotelio, desde el ciego hasta el recto presenta una cara serosa en anterior y una adventicia hacia posterior

 

Parte II

Glándulas salivales

*Campo de glándula submaxilar

-Submaxilar: predominan acinos serosos (mixta)

-Sublingual: predominan los acinos mucosos (mixta)

-Parótida: acinos serosos (simple)

Al ser órganos macizos, se describen desde fuera hacia dentro

1.-Cápsula: TCCD con tejido adiposo que envía tabique para dividir el órgano en islotes

2.-Acinos:

-Mucosos: núcleos basales y aplanados. Tinción acidófila pálida

-Serosos: núcleos esféricos y centrales. Tinción basófila

3.-Conductos: intralobulillares e inter/extralobulillares

Intralobulillares:

-Intercalares: igual o más pequeños que un acino, luz casi invisible

-Estriados: más grandes que un acino, epitelio cúbico simple, alta acidofilia por mitocondrias y proteínas que modificarán el producto de excresión. Luz evidente

*Se marca conducto intralobulillar estriado con su luz y el epitelio cúbico simple de tinción acidófila

Inter/extralolulillares:

Inmersos en tejido conectivo, van a recibir a los conductos más pequeños, por las capas que lo conforman serán más desarrolladas, resistiendo así las presiones de  carga. Cuentan con una gran luz y generalmente están formados por epitelio cúbico estratificado

*Se marca conducto extralobulillar inmerso en su tejido conectivo

Bibliografía recomendada:

Histología médico-práctica, por H.A. Brusco. 1era Edición. Capítulo 14

 

Sem. BC 8: Bioenergética celular. Procesos metabólicos celulares.

Seminario de integración 8: Bioenergética celular. Procesos metabólicos celulares.

Programa:

– Obtención de energía. Transportadores (carriers de alta energía). Oxidación de glucosa y ácidos grasos. Generación de la fuerza protón-motriz para los procesos que requieren energía.

– Mitocondria y compartimentos involucrados en la bioenergética celular. Técnicas de fraccionamiento subcelular y submitocondrial para el estudio de componentes mitocondriales.

 

Bioenergética -> Mitocondrias y peroxisomas

Mitocondrias:

• Membrana interna y externa
• Crestas
• Matriz
• Espacio intermembranoso

Membrana interna

• Altamente regulada -> altamente impermeable
• Tiene fosfolípidos propios

Gracias al fraccionamiento sub-mitocondrial se pueden obtener los diferentes componentes de las mitocondrias

Se hayan conectadas entre sí. También son muy dinámicas, movidas por proteínas asociadas al citoesqueleto

Su origen: endocitosis

• Componentes de la membrana interna -> origen BACTERIANO
• Componentes de la membrana externa-> origen EUCARIONTE

Las mitocondrias:

• Se generan de otras mitocondrias
• No “de novo”
• No están totalmente codificadas en el genoma, poseen su propio genoma mitocondrial, “ADN procarionte”, sin intrones. Este ADN se hereda solo por la vía materna

Doble origen de las proteínas mitocondriales -> generadas por genoma eucarionte, implicando un importe de proteínas citosólicas a la mitocondria

• Secuencia de importación mitocondrial -> a-hélice: carga positiva (+), no polares -> anfipáticas
• TOM -> Extramembranosa
• TIM (2) -> Intramembranosa

 

Pasos

1.-Las proteínas que entran a la mitocondria están totalmente traducidas, es estado desplegado -> interactúan con chaperonas (Hsp70, ATP dependiente) -> TOM -> reconocimiento

2.-TIM (2): diferencia de potencial:

Interior de la matriz: negativo (-)

Espacio intermembrana: positivo (+)

a-hélice: carga de electrones negativa -> favorece ingreso -> consume ATP

 

Funciones de las mitocondrias

• Bioenergética: síntesis de ATP celular
• Participa en síntesis de hormonas, a partir del colesterol, esteroidogénesis, que no se da en todas las células del cuerpo
• Reservorio de calcio (secundario)
• Señalización intracelular durante apoptosis -> vía mitocondrial

Reacciones químicas acopladas

A –> B + C: espontánea, generando ATP

B + C –> A: no espontánea, gasta ATP

Acoplamiento de ambas reacciones -> proximidad espacial de enzimas, energía liberada es usada por la otra reacción

ATP –> ADP + P

 

Reacción óxido-reducción por redox

Mitocondrias tienen capacidad de atracción -> reacción espontánea -> libera energía

Diferencia de potencial de reducción

Las coenzimas participan en la aceptación temporal de enzimas:

• FAD –> FADH2
• NAD+ –> NADH

Actúan como aceptadores temporales

 

Catabolismo de los hidratos de carbono:

1. Glucolisis
2. Ciclo de Krebs
3. Catabolismo de ácidos grasos

 

Glucolisis

• Glucosa -> ruptura -> piruvato
• 2 moléculas de ATP por glucosa
• Piruvatos por difusión simple a la mitocondria (purinas)
• En matriz mitocondrial -> AcetilCoA (se rompe un carbono)
• Complejo del piruvato -> generación de AcetilCoA

Ciclo de Krebs

• Progresiva ruptura de enlaces covalentes -> CO2
• Electrones libres -> coenzimas -> NADH y FADH2

Catabolismo de ácidos grasos

• b-oxidación
• Matriz mitocondrial
• Fragmentación del ácido graso -> acortamiento

 

Mecanismo de producción del ATP

• Electrones en coenzimas: liberados en complejos respiratorios
• Bombeo de proteínas hacia espacio intermembrana, algunos componentes facilitan el transporte:

Grupos hemos: aceptan electrones temporalmente, reacción espontánea

Ferro-sulfoproteínas: aceptan electrones temporalmente, reacción espontánea

Ubiquinona: aceptan electrones temporalmente, reacción espontánea

• Aceptor final -> O2 -> capta los electrones

Gradiente doble

• Intermembrana: llegan electrones
• Matriz: llegan protones

Entonces, ATP sintasa:

• Por aquí llegan los protones -> choca ADP con el protón (ADP + P) -> ATP
• Acoplamiento de energía liberada e ingreso del protón

 

Fosforilación oxidativa

• Desacoplamiento mitocondrial: condiciones fisiológicas y patológicas
• Es necesario el gradiente
• EJ: grasa parda -> desacoplamiento -> calor (fríos intensos -> supervivencia)

 

Peroxisomas

• Metabolismo O2 y reacciones especializadas
• Presentes en todas la células humanas
• Generan peróxido de hidrógeno (H2O2) -> enzima catalasa -> H2O
• B-oxidación -> generación de AcetilCoA: ácidos grasos especiales, largos, vegetales -> cortados -> llevados a las mitocondrias
• Origen: brotan del RE
• Proteínas llegan totalmente traducidas al peroxisoma
• Síndrome de Zellweger: alta concentración de ácidos largos de cadena larga, ausencia de peroxisomas, defectos hepáticos

Bibliografía recomendada:

La Célula, por Cooper & Hausman. 6ta Edición. Capítulo 11