Programa
SG2: TECNICAS DE BIOLOGÌA MOLECULAR APLICADAS A LA INVESTIGACIÒN Y DIAGNOSTICO EN GENETICA Técnicas involucradas en la caracterización del genoma: Extracción de ADN. Utilización
de Enzimas de restricción, Electroforesis de los ácidos nucleicos. Secuenciación de ADN. Método
de Sanger y métodos de secuenciación de alto rendimiento (high‐throughput). Southern blot; PCR
y subtipos (alelo específica, RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism). Aplicación en la
detección de variantes y su aplicación en pruebas de paternidad e identificación forense.
Concepto de haplotipo. Uso de modelos animales y técnicas de biología molecular en
investigación biomédica: Bibliotecas génicas. Vectores. Obtención de ratones knock‐out y
knock‐in mediante la técnica de CRISPR/Cas.
Técnicas 1
- Secuenciación del ADN:
Método de Sanger y secuenciación de alto rendimiento
- Southern Blot
- PCR: variantes de PCR
- Crispr/Cas9
Southern Blot
- Evidencia la presencia de determinadas secuencias en el genoma
- 8 pasos clave:
- Extraemos ADN en sangre periférica (es requerido bastante material genético)
- Fragmentamos moléculas de ADN, disminuyendo su complejidad, quedando fragmentos más pequeños. Se utilizarán endonucleasas bacterianas que cortan cuando encuentran una secuencia específica, siendo este el sitio específico de reconocimiento. Hay enzimas que cortan fragmentos más grandes y otos más pequeños. Se fragmentarán de manera ordenada
- Se separan fragmentos por su tamaño gracias a electroforesis en geles de agarosa
- Se realiza el blot (transferencia) del gel hacia una membrana
- Se utilizan sondas de ADN para determinar la presencia. Las sondas serán complementarias a las secuencias de ADN que se buscarán, además estarán marcadas con fluoróforo. Las sondas pueden hibridar cuando existe alta homología, tolerando algunos «missmatches». Por este motivo, no se detectarán cambios en un único par de bases
- Se elevará la temperatura, uniéndose sondas a cadena complementaria
- Se bajará la temperatura
- Se lavará y quitarán sondas libres
Genes ortólogos
Son genes que están presentes en organismos de distintas especies, pero provienen de un ancestro en común. Un ejemplo: gen de la ARN polimerasa 2
Usos de genes ortólogos: enfermedad de Huntington. Será necesario conocer gen de posible patología para aplicar un Southern Blot.
Dato:
«A finales de la década de 1970, Nancy Wexler inició la investigación de la mutación genética que causa la enfermedad de Huntington…
Tras averiguar que en Venezuela había un clan familiar que mostraba una incidencia elevada de la enfermedad de Huntington, Wexler viajó a lago de Maracaibo en 1979 para obtener muestras de sangre de 500 personas… Hacia 1983 se descubrió que el problema se localizaba en el brazo corto del cromosoma 4. Sin embargo, todavía tuvo que transcurrir otra década para la identificación de un gen que elabora una proteína llamada huntingtina.
El descubrimiento de ese gen en 1993 constituyó uno de los mayores éxitos de la genética de enfermedades. El proyecto duró 14 años… «
50 Cosas que hay que saber sobre genética
PCR: variantes aplicativas
- Se pueden realizar pruebas para determinar ciertas mutaciones
- Detecciones de inserciones y deleciones por PCR: darán fragmentos con longitud diferentes entre wild type/mutados
PCR alelo específica (técnica extremadamente específica)
- Mutaciones puntuales por sustitución
- Se busca diseñar un primer que sólo pueda unirse de manera perfecta excepto en el último nucléotido wild type, pero sí en su 100% al patogénico
- Wild type: se encontrará sin amplificación (paciente sano)
- Mutación: se encontrará amplificada
PCR RFLP
- Mutación puntual por sustitución de bases
- Alelo wild type es el blanco de enzima de restricción
- Ante una mutación dicha enzima no podrá actuar
- Se amplifican ambas variantes
- Se utiliza enzima de restricción
- Material genético mutado será más largo, no se encontrará «cortado», siendo más pesado. Wild type estará cortado
CRISPR/Cas9
Adjunto información de otra entrada: Sem. 5 BC: Técnicas
La tecnología CRISPR/Cas9 es una herramienta molecular utilizada para “editar” o “corregir” el genoma de cualquier célula. Eso incluye, claro está, a las células humanas. Sería algo así como unas tijeras moleculares que son capaces de cortar cualquier molécula de ADN haciéndolo además de una manera muy precisa y totalmente controlada. Esa capacidad de cortar el ADN es lo que permite modificar su secuencia, eliminando o insertando nuevo ADN
Todo comienza con el diseño de una molécula de ARN (CRISPR o ARN guía) que luego va a ser insertada en una célula. Una vez dentro reconoce el sitio exacto del genoma donde la enzima Cas9 deberá cortar
El proceso de editar un genoma con CRISPR/Cas9 incluye dos etapas. En la primer atapa el ARN guía se asocia con la enzima Cas9. Este ARN guía es específico de una secuencia concreta del ADN, de tal manera que por las reglas de complementariedad de nucleótidos se hibridará en esa secuencia (la que nos interesa editar o corregir). Entonces actúa Cas9, que es una enzima endonucleasa (es decir, una proteína que es capaz de romper un enlace en la cadena de los ácidos nucléicos), cortando el ADN. Básicamente podemos decir que el ARN guía actúa de perro lazarillo llevando a Cas9, el ejecutor, al sitio donde ha de realizar su función
En la segunda etapa se activan al menos dos mecanismos naturales de reparación del ADN cortado. El primero llamado indel (inserción-deleción) hace que, después del sitio de corte (la secuencia específica del ADN donde se unió el ARN guía), bien aparezca un hueco en la cadena, bien se inserte un trocito más de cadena. Esto conlleva a la perdida de la función original del segmento de ADN cortado
Un segundo mecanismo permite la incorporación de una secuencia concreta exactamente en el sitio original de corte. Para esto, lógicamente, hemos de darle a la célula la secuencia que queremos que se integre en el ADN
Desde 2013, el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación génica en varias especies. Al administrar la proteína Cas9 y los ARN guía apropiados a una célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas secuencias serán complementarias a las de los ARN guía utilizados. Esto permite la eliminación funcional de genes o la introducción de mutaciones (tras la reparación del corte realizado por la maquinaria celular de reparación del ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los genes, modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información genética
Link de interés:
https://aprobemosjuntos.wordpress.com/category/proyecto-2018/biologia/sem-5-bc/
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