Seminario de integración 5: Técnicas
Programa:
-Extracción de ADN; Electroforesis de acidos nucleicos y proteínas; fraccionamiento subcelular
-Técnicas de estudio de localización y función de proteínas: fraccionamiento subcelular; Inmunohistoquímica/inmunofluorescencia; Western blot
-Fundamentos de PCR como modelo de replicación del ADN in vitro.
-Introducción a técnicas de ADN recombinante (generación de proteínas de fusión; vectores de expresión;animales transgénicos, método de CRISPR-cas, como herramientas de estudio de la función génica;
Fundamentos, utilidades y aplicaciones.
Separación de fragmentos (electroforesis)
Para la visualización de los fragmentos de ADN se utiliza la electroforesis en una solución de agarosa o filtros de nitrocelulosa. Esto es colocar los fragmentos obtenidos, luego del corte, en geles de agarosa. Estos geles forman mallas que deben ser atravesadas por los fragmentos de ADN
El ADN avanza hacia el ánodo positivo ya que está constituido por muchas cargas negativas. Las partículas de ADN de menor tamaño son las que se mueven a mayor velocidad ya que pueden atravesar las mallas de agarosa más fácilmente. A la solución se le agrega un colorante que sirve de guía para saber cómo avanza la electroforesis, luego al gel se le agrega un colorante fluorescente sometiendo la solución a luz ultravioleta permitiendo fotografiar
Identificación de fragmentos de ADN (Sondas del ADN-Blotting)
Luego del corte, re-pegado y selección de los fragmentos de ADN, se puede identificar cada fragmento de ADN mediante una electroforesis con todos los fragmentos, estos se van a superponer entre sí generando una apariencia homogénea de mancha extendida, donde no se identifica ninguna clase de fragmento
Para solucionar esto se agrega a una solución alcalina que permite desnaturalizar las hebras de ADN, y luego se dispone de una cadena simple con una secuencia conocida a la que se rotula como marcador, esta secuencia conocida y rotulada se denomina sonda del ADN. Una sonda es un fragmento de entre 50 pb y hasta 2 kb que puede ser de ADN o ARN, esta se une específicamente por complementariedad de bases a un fragmento de ácido nucleico a detectar. Es decir, se denomina así porque permite sondear un mar de fragmentos y sólo se unirá a uno que posea la secuencia complementaria de bases. Luego de la unión (hibridación) puede observarse gracias a la radiación emitida por el marcador
Si se coloca una membrana de nylon sobre el gel con la mancha electroforética y se comprime sobre este, una cantidad de fragmentos se pegan a la membrana, llamándose impronta (huella) o blot (inglés)
Esto fue inventado por Edwin Southern en 1975 por lo que se denomina Southern blot. Existen técnicas similares para el ARN (Northern blot) y proteínas (Western blot)
Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica es un procedimiento que tiene como objetivo detectar, amplificar y hacer visible un antígeno específico, que generalmente es una proteína. Esta técnica permite identificar la localización de una sustancia específica a nivel tisular o celular. Se basa en la utilización de anticuerpos que se unen específicamente a una sustancia que se quiere identificar (antígeno primario)
Estos anticuerpos pueden tener unida una enzima o esta puede encontrarse unida a un anticuerpo secundario que reconoce y se une al primario
Aplicado a un tejido orgánico, el anticuerpo primario se une específicamente al sustrato y se aprovecha la actividad enzimática para visualizar la unión. De esta manera se consigue un complejo sustrato-anticuerpos-enzima unido al lugar donde se encuentre el sustrato y mediante la activación de la enzima con la adición de su sustrato se genera un producto identificable donde se encuentre el complejo
Inmunohistofluorescencia
La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para microscopía óptica con un microscopio de fluorescencia y se utiliza principalmente en muestras microbiológicas. Esta técnica utiliza la especificidad de los anticuerpos frente a su antígeno para dirigir los colorantes fluorescentes a dianas de biomoléculas específicas dentro de una célula, y por lo tanto permite la visualización de la distribución de la molécula objetivo a través de la muestra. La región específica que reconoce un anticuerpo sobre un antígeno se denomina epítopo
Se han realizado esfuerzos en el mapeo de epítopos ya que muchos anticuerpos pueden unir el mismo epítopo y los niveles de unión entre anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden variar. Además, la unión del fluoróforo al anticuerpo en sí no puede interferir con la especificidad inmunológica del anticuerpo o la capacidad de unión de su antígeno
La inmunofluorescencia es un ejemplo ampliamente utilizado de inmunotinción (que usa anticuerpos para teñir proteínas) y es un ejemplo específico de inmunohistoquímica (el uso de la relación anticuerpo-antígeno en los tejidos). Esta técnica utiliza principalmente fluoróforos para visualizar la ubicación de los anticuerpos
Western blot
El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica analítica usada en biología celular y molecular para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres etapas para lograr esto: separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y, finalmente, visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática o fluorescencia, entre otros métodos. De esta misma forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a las otras proteínas
PCR
Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado
Elementos necesarios
- Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
- Dos cebadores o iniciadores (primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y no a mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
- Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+)
- Iones monovalentes, como el potasio
- Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
- ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).
- ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
- Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo
Pasos
– INICIO: Consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor
– DESNATURALIZACIÓN: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual
– ALINEAMIENTO O UNIÓN DEL CEBADOR: A continuación, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada
– EXTENSIÓN O ELONGACIÓN DE LA CADENA: En esta etapa actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5’→ 3′, uniendo el grupo 5′-fosfato de los dNTP con el grupo 3′-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar
– ELONGACIÓN FINAL: Se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado
– CONSERVACIÓN: Este paso, que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.
Proteínas de fusión
Las proteínas de fusión o proteínas quiméricas son aquellas formadas a partir de la traducción de dos o más genes previamente independientes que se han unido bien por algún proceso natural o artificialmente en el laboratorio. Cada uno de estos genes habría dado lugar, originalmente, a una proteína independiente.
Las proteínas de fusión presentan propiedades diferentes a las de las proteínas originales. Las obtenidas artificialmente se consiguen empleando tecnología de ADN recombinante, es decir uniendo 2 o más fragmentos de ADN previamente independientes, y se utilizan en distintos campos, por ejemplo en medicina como medicamentos o con fines de investigación.
Las proteínas de fusión naturales pueden producirse espontáneamente en diferentes circunstancias, por ejemplo en ciertos tipos de cáncer como la leucemia mieloide crónica
Vectores de expresión
El vector (plásmido o virus) se utiliza para introducir un gen específico en una célula diana, guiando a la célula en los mecanismos de síntesis proteica. Los vectores de expresión génica están diseñados para contener secuencias reguladoras que actúan como regiones promotoras y potenciadoras, que conducen a la transcripción eficaz del gen transportado.
El objetivo de un vector de expresión bien diseñado es la producción de una cantidad significativa de RNA mensajero estable, y por lo tanto de proteínas. Los vectores de expresión son herramientas básicas para la biotecnología y la producción de proteínas. Un ejemplo es la insulina que se utiliza para tratamientos médicos de la diabetes.
Animales transgénicos
¿Cómo obtener un animal transgénico?
Existen tres maneras de modificar genéticamente un animal. La primera es la ‘microinyección’. Esta técnica es fácilmente aplicable a gran variedad de especies. El problema de ella es que el transgen se inserta al azar, por ello solo un 5% de los ovulos dan lugar a un animal vivo.
En esta técnica se provoca una sobreovulación de las hembras para asegurar el proceso, se extraen los óvulos que son fecundados in vitro. En el núcleo de esos óvulos se inyecta el nuevo transgen. Los óvulos modificados se reintroducen en las hembras, previamente tratadas con hormonas que induzcan el momento adecuado de su ciclo ovárico para recibir el embrión y que el embarazo progrese
La segunda técnica son los retrovirus como vector. Con esta técnica se consigue que el transgen esté presente en todas las células del individuo, pero, como en el caso de la microinyección, el gen también se inserta al azar. En esta técnica se elige un virus benigno y se atenúa hasta eliminar su carga viral. Se inserta en el virus el transgen. El virus actúa como un transporte de este transgen y cuando comienza a replicarse en el interior de las células el transgen se libera. La problemática de esta técnica es que el virus utilizado se reproduzca en el organismo y pueda dar lugar a enfermedades
Por último está el uso de células madre embrionarias. Es el método menos aleatorio y se utiliza cuando es importante dirigir las secuencias genéticas a lugares específicos.
Es posible modificar geneticamente las células cuando estas están en cultivo. Estas modificaciones pueden ser eliminar o sustituir un gen. Las células modificadas son inyectadas en un los embriones en fase blastocisto. Los individuos que se originan portan el gen solo en un porcentaje de sus células
¿Qué usos tienen los animales transgénicos?
A nivel comercial, el uso es diverso. Desde los años 80 la transgénesis ha permitido a los científicos investigar en la mutación de ciertas especies con el fin de que el beneficio de sus producciones animales sea mayor. Por ejemplo, se implantan transgenes para fortalecer el sistema inmunológico del animal y hacerlo resistente o inmune a ciertas enfermedades. En ciertos casos la inmunidad puede transmitirse a sus descendientes. En otros casos se les implantan hormonas del crecimiento para que crezcan más y a mayor velocidad
Con fines terapeúticos la modificación genética de animales se utiliza para avanzar en el tratamiento de enfermedades o generar medicamentos. Para el estudio de enfermedades se aísla el gen humano causante de la enfermedad y se inserta en el animal, para que este desarrolle la enfermedad de la misma manera que lo haría un humano. Estos animales transgénicos también pueden utilizarse como ‘bioreactores’. Son animales capaces de producir medicamentos o proteínas humanas que ayuden a tratar ciertas enfermedades. Esta técnica, llamada ‘pharming’, se introduce la porción de ADN que codifica ese producto en partícula en el animal para que la produzca. Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para la producción de insulina
CRISPR/Cas9
La tecnología CRISPR/Cas9 es una herramienta molecular utilizada para “editar” o “corregir” el genoma de cualquier célula. Eso incluye, claro está, a las células humanas. Sería algo así como unas tijeras moleculares que son capaces de cortar cualquier molécula de ADN haciéndolo además de una manera muy precisa y totalmente controlada. Esa capacidad de cortar el ADN es lo que permite modificar su secuencia, eliminando o insertando nuevo ADN.
Todo comienza con el diseño de una molécula de ARN (CRISPR o ARN guía) que luego va a ser insertada en una célula. Una vez dentro reconoce el sitio exacto del genoma donde la enzima Cas9 deberá cortar.
El proceso de editar un genoma con CRISPR/Cas9 incluye dos etapas. En la primer atapa el ARN guía se asocia con la enzima Cas9. Este ARN guía es específico de una secuencia concreta del ADN, de tal manera que por las reglas de complementariedad de nucleótidos se hibridará en esa secuencia (la que nos interesa editar o corregir). Entonces actúa Cas9, que es una enzima endonucleasa (es decir, una proteína que es capaz de romper un enlace en la cadena de los ácidos nucléicos), cortando el ADN. Básicamente podemos decir que el ARN guía actúa de perro lazarillo llevando a Cas9, el ejecutor, al sitio donde ha de realizar su función.
En la segunda etapa se activan al menos dos mecanismos naturales de reparación del ADN cortado. El primero llamado indel (inserción-deleción) hace que, después del sitio de corte (la secuencia específica del ADN donde se unió el ARN guía), bien aparezca un hueco en la cadena, bien se inserte un trocito más de cadena. Esto conlleva a la perdida de la función original del segmento de ADN cortado.
Un segundo mecanismo permite la incorporación de una secuencia concreta exactamente en el sitio original de corte. Para esto, lógicamente, hemos de darle a la célula la secuencia que queremos que se integre en el ADN.
Desde 2013, el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación génica en varias especies. Al administrar la proteína Cas9 y los ARN guía apropiados a una célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas secuencias serán complementarias a las de los ARN guía utilizados. Esto permite la eliminación funcional de genes o la introducción de mutaciones (tras la reparación del corte realizado por la maquinaria celular de reparación del ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los genes, modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información genética.
*Aclaración: para este seminario, recomiendo la lectura de papers, artículos de Internet, documentos, archivos, etc. ya que son muchísimo más y mejor desarrollados y extensos en estos
Links:
Electroforesis: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis
Inmunohistoquimíca: https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunohistoqu%C3%ADmica
Inmunohistoflurescencia: https://en.wikipedia.org/wiki/Immunofluorescence
Western blot: https://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot
PCR: https://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa
PCR: http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=16764
Secuenciación del ADN: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/dna-sequencing
Proteínas de fusión: https://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna_de_fusi%C3%B3n
Vectores de expresión: http://www.solmeglas.com/es/118-vectores-de-expresion-genica-y-kits-
Animales transgénicos: http://www.teinteresa.es/ciencia/animales-transgenicos_0_1128489010.html
CRISPR/Cas9: http://www.dciencia.es/que-es-la-tecnologia-crispr-cas9/
CRISPR/Cas9: https://es.wikipedia.org/wiki/CRISPR
Aprobemos Juntos 